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在real-time Q-PCR技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的问题有待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用real-time Q-PCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录（RT）效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。生猪屠宰厂(场)连接着生猪产销等上下游环节，便于“顺藤摸瓜”及时发现和追溯潜在风险。

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与传统的PCR技术相比，Real-time Q-PCR的不足之处是：（1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；（2）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了real-time Q-PCR的复合式（multiplex）检测的应用能力；夏秋季节消毒没什么问题，但到了冬天，他们仍然在舍外熏蒸消毒，这样的效果是很差的。（3）目前real-time Q-PCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。

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荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、***及耗材。这两个发现的结合以及相应的仪器和***的商品化发展导致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的运用。

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进行荧光定量PCR体系的配制时***i好在冰上进行，操作环境不用非得在超净台中进行，环境安静整洁都可以。因为每一个梯度要做三个重复，因此先在1ml的无菌离心管中配制好后再分装入96孔板中。实验中我使用过荧光定量八联管和96孔板，个人推荐96孔板。因为八联管你需要盖上盖子，而且盖子比较的难按下去，稍不慎就把八联管弄断或者液体撒出来。有的时候一下忘记了是从哪边开始的。96孔板比较方便，加完样品后只需附上一层膜，用它自带的板子抚平即可。上机器前***i好离心一下，让贴在管壁上的液体流下来同时也消掉气泡。当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。

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FQ-PCR在***栓测中***有价值的应用领城就是对感i染性***的诊斷,只要有限的核酸序列清楚,运用FQ-PCR技术,检测任何病原体。目前,对一些培养周期长或缺乏稳定可靠的检测手段的病原体,可以考虑用FQ-PCR检测,为临床诊断提供依据FQ-PCR对病原体的检测克服了免i疫学检測的“窗口期“问题,可判断***是否隐性或亚临床状态。FQ-PCR技术可以应用于肿癟的研究及诊断。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。

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实时荧光定量PCR的基本原理：理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。分子遗传学诊断技术多以遗传物质DNA为检测对象，不需要进行细胞培养，为传统的细胞染色体核型分析技术提供了有效的补充。